1453 yılından önce İstanbul, Konstantinopolis adıyla bilinen bir şehirdi. Fatih Sultan Mehmet’in fethiyle şehrin ismi İstanbul oldu ve Osmanlı Devleti’nin başkenti ilan edildi. Din ve kültürlere saygısı ile bilinen Fatih Sultan Mehmet fetih sonrası, 15 Ekim 360 tarihinde yapılmış olduğu söylenen Ayasofya'yı özel koruma altına aldı. 1 Haziran 1453'te Fatih Sultan Mehmet İstanbul'daki ilk cuma namazını burada kıldı ve Ayasofya'nın Osmanlı himayesi altında cami olarak hizmet vereceğini duyurdu.
1481'de Ayasofya’nın ilk minaresi yapıldı. Fatih Sultan Mehmet'ten sonra tahta geçen 2. Bayezid zamanında bir minare daha inşa edildi. Diğer iki minare de 2. Selim zamanında, Mimar Sinan tarafından yapılan yenileme çalışmaları sırasında dikildi. Bu sebeple Ayasofya'nın 4 minaresi de birbirinden farklıdır.
Ayasofya, Doğu Roma İmparatorluğu’nun İstanbul’da yapmış olduğu en büyük kilisedir. Ayasofya Camii, kiliseden çevrildiği halde adı değiştirilmeyen tek abidedir.
404 yılında çıkan ayaklanmada yakılan Ayasofya, 416 yılında ibadete açıldı. 532 yılında çıkan bir başka ayaklanmada yine yakıldı, 537 yılında ibadete yeniden açıldı. Camiye dönüştürüldükten sonra 1506 yılında, içinde bulunan Bizans mozaikleri badana edilerek kapatıldı. Bütün devirlerde Ayasofya Cami, devamlı olarak tamir ve imar olundu.
Ayasofya'da Kadir geceleri 6000 kadar kandil yakıldığı rivayet edilir. Fatih Sultan Mehmet'le başlamak üzere sultanların Kadir gecelerinde teravih namazını Ayasofya'da kıldıkları söylenir.
Yaklaşık 500 yıl cami olarak hizmet veren Ayasofya, 1923'te Cumhuriyet’in ilanından sonra cami olarak kullanılmaya devam etse de 1931'de kapatıldı. 1931'de Amerika Bizans Enstitüsü'nün kurucusu Amerikalı Arkeolog Thomas Whittemore, Ayasofya'daki mozaiklerin tekrar ortaya çıkarılması için Türkiye'den izin istedi. Mustafa Kemal Atatürk’ün emri ve 24 Kasım 1934 tarihinde çıkarılan bir kararname ile Ayasofya Cami müzeye dönüştürüldü. Müzedeki çalışmalar 15 yıl sürdü ve 1947'de tamamlandı. Ayasofya Müzesi, UNESCO Dünya Mirası listesine girmiştir.